第三章:实时荧光定量PCR的应用
一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值
在进行基因表达量的相对定量分析时,内参基因的选择显得尤为重要。以下是几个选择内参基因的建议:
- 始终选择表达量丰盈且稳定的基因作为内参基因;
- 避免盲目选择常用的内参基因;
- 常见的内参基因包括:GAPDH、Actin 和 Tubulin。
内参基因的适当选择将直接影响结果的有效性。在将内参基因纳入分析后,结果的计算将更加准确。
二、绝对定量
绝对定量是通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值(即拷贝数)。以下是标准品的类型:
- A/克隆质粒;
- B/PCR产物;
- C/cDNA(注意:绝对定量时不可使用)。
拷贝数的计算可通过以下公式得出:
平均分子量(MW)的计算方式如下:
- dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基);
- ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基);
- ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。
拷贝数的计算公式为:
(6.02 x 1023 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml。
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